有用过His-tag进行蛋白纯化的人，或多或少都有这样的经验: 蛋白纯度低、纯化出来的蛋白失去原有结构或功能受到影响、难以从哺乳类细胞表达系统中纯化出目标蛋白…等，因此科学家开始尝试以不同亲和标签进行蛋白纯化。因为Strep-tag系统的纯化过程温和、目标蛋白纯度高，且相容于多种表达系统的特性，愈来愈受到大众的欢迎。但是，你知道Strep-tag这个纯化系统发展是怎么发展而来的吗? 这得从功能性抗体开始说起…

功能性抗体的出现

随着生物制药技术的发展，抗体也因此成为科学家研究的热门领域。但在80年代初，功能性抗体的表达一直是个问题，酵母表达系统中表达出来的蛋白只有部分具有功能，在其他的微生物表达系统中，也没有成功的先例。一直到80年代末，一个具有功能性的McPC603抗体的Fv片段终于成功的在E. coli被中表达出来¹。这一方法的出现，使得科学家能更快速的表达具有不同基因变异的抗体片段，并能对这些变异所引发功能改变进行检视。

抗体纯化没有想象中那么简单

将重组抗体片段表达出来之后，必须将此片段纯化出来，当时多以亲和层析法搭配目标抗体的抗血清(antiserum)进行蛋白纯化，但这一方法常常受到限制: 在研究一个未知目标蛋白时，常出现没有抗血清或是相容抗体的情况，这严重影响了实验进度。为此，科学家尝试找出更有效的一步纯化法。首先，他们考虑在重组蛋白上加入短肽标签(tag)，当时市面上已有myc、flag、KT3 epitope等标签，但这些主要适用于侦测目标蛋白，纯化蛋白效果非常有限，或非常昂贵。随着His-tag的问世，让固定化金属离子亲合层析法(Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC)纯化目标蛋白变为可能，这的确提高了蛋白纯化的效率。但是His-tag仅适用于纯化，无法用于侦测目标蛋白，而且使用His-tag进行Fv片段纯化时，高盐浓度常使得Fv片段解离成两个单体(V_L及V_H)，难以保持抗体的功能性及正确结构²。

更高能的短肽标签呼之欲出

要解决这些问题，科学家需要找出一个具备以下功能的短肽标签。

①能被融合到目标蛋白上，且不会影响蛋白功能

②能直接以现有试剂侦测出来

③与配体的结合稳定、特异性高且容易控制。

经过一番搜索，发现链霉亲和素(Streptavidin)在特定情况下，能与不同短肽进行可逆性的结合，再加上其与生物素(biotin)极高的亲合力，且与背景蛋白的非特异性结合机率低，链霉亲和素已被应用在许多检测系统中，甚至能作为一个稳定的介质来固定蛋白。链霉亲和素在不同溶液条件中稳定性好，所以能够重复被利用，因此，90年代初，科学家开始寻找一个能与链霉亲和素特异性结合的亲和标签²。

终于找到了第一代Strep-tag系统 : Strep-tag vs Streptavidin

因先前已知可用E.coli系统表达出具有功能性的Fv片段¹，科学家又希望能确认标签是否会影响蛋白功能，所以选择了已知的D1.3抗体Fv片段做为实验模型，以便检测加上的短肽标签是否影响了这片段与其抗原结合的特性³。接着，一连串能与链霉亲和素结合的标签被接到V_H domain上，大量筛选之后，得到了一个适用于进行一步纯化的Strep-tag (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly) ³，与生物素相比，Strep-tag和链霉亲和素间的亲和力较低，因此可以使用生物素衍生物Diaminobiotin，进行在生理条件下的温和洗脱。又因整个纯化流程温合，含盐浓度低，纯化出来的 Fv片段完整且功能不受影响³。除此之外，这个标签还能被应用在Western blot或ELISA实验中，以链霉亲和素酶偶联物(Streptavidin-enzyme conjugates)来检测纯化出的Fv片段。后续测试了以Strep-tag来纯化抗体以外蛋白的可能性，证实了这个一步纯化系统可以被广泛使用在不同类型的蛋白上³。

因为不完美，所以有了第二代: Strep-tag II vs Strep-Tactin®

但Strep-tag仅能接在目标蛋白的C端，对于需将标签接在N端或是蛋白内部的实验，非常的不实用。因此科学家进一步优化了这个标签，便有了现在被广泛使用的Strep-tag II (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)⁴。但即便足以用于蛋白纯化，科学家对Strep-tag II与链霉亲和素的结合强度低这点仍不甚满意，因为在比较特殊的纯化条件中效率会受影响。于是进行了链霉亲和素的改造，发展出Strep-Tactin®。Strep-Tactin®:Strep-tag II的亲和力较Streptavidin:Strep-tag II提升了近100倍，这个改变使得洗脱时需改用脱硫生物素(Desthiobiotin)⁵，但过程一样温合。这就是二代Strep-tag系统，在过去近20年间，逐渐被广泛应用于纯化或侦测蛋白质中，还甚至发展出细胞分离检测的方法⁶。

总觉得还能更好，一起看看第三代: Twin-Strep-tag vs Strep-Tactin®XT

即便亲和力已提升，在某些状况下，Strep-Tactin®的使用仍有所限制，尤其是在需要极高亲和力的应用之中，例如检测蛋白质间的交互作用、或是从目标蛋白浓度低的样本中进行纯化。因此科学家利用总结合力(Avidity)的原理，将两个Strep-tag II以linker连接在一起 : Twin-Strep-tag⁷。这一新标签的出现再度提升了目标蛋白与Strep-Tactin®的链接强度，改善了低浓度样本纯化效果⁸，还能于抓取蛋白复合体、检视蛋白间的交互作用^{7, 9}。

美中不足的是，Strep-Tactin®在变性条件下并不稳定(例如:使用尿素时)，无法进行纯化，且进行批量纯化时，即使搭配Twin-Strep-tag，效果仍有改善的空间。为此，科学家再次改造了Strep-Tactin®，得到与Twin-Strep-tag亲和力更上一层楼的Strep-Tactin®XT(XT意指extremetight)¹⁰。经过这次的优化，科学家首次创造出一个纯化系统，其中标签与配体的键结力几近共价，但链结仍保持可逆(注:Strep-tag II也能与Strep-Tactin®XT结合)。因亲和力的增加，即使经过多次清洗步骤，蛋白也不会从Strep-Tactin®XT上解离，提高了目标蛋白的得率。需注意的是，洗脱步骤必须使用生物素，但是整个纯化流程与前几代一样温合，纯度超过95%，这就是最新一代Strep-tag系统。用Strep-Tactin®XT来纯化时，得率及纯度都提高；且Twin-Strep-tag搭配后还能用在Biacore芯片^{11, 12}、微量滴定板或ELISA中来固定蛋白，进行后续检测，是一个多用途的亲和标签系统。

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Strep-tag与His-tag系统的比较

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参考文献

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10.   Carl U (2016) Poster session presented at: PEGS Bosten 2016.

11.   Dintner S, Heermann R, Fang C, Jung K& Gebhard S (2014) J Biol Chem.,289,27899-910.

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