多肽芯片（也叫多肽表位芯片）是将多肽的集合展示到固态载体的表面，载体可以是玻璃或塑料材质的芯片。多肽芯片被科学家用于生物学、药物学和药理学中蛋白与蛋白作用研究，包括结合特性、功能和动力学特性研究。在基础研究领域，蛋白芯片通常被用于酶的表征（包括激酶、磷酸酶、蛋白酶、乙酰转移酶和脱乙酰化酶等）、抗体表位决定簇鉴定和蛋白结合的关键基团鉴定等。实际运用包括血液标志物发现、病人个体在疾病进展过程中体液免疫反应的变化、治疗效果的监控、病人分级、诊断工具开发和疫苗研发等[1]。
PEPperPRINT是一家年轻的创兴型生物公司，隶属于德国癌症研究中心，位于德国海德尔堡市。核心技术是由诺贝尔奖获得者Harald zur Hausen教授在2003年建立的“芯片依赖的多肽库”研究组研发，相关结果于2007和2008年分别发表在Science和Angewandte Chemie顶级期刊上[2,3]。由于在高密度多肽芯片开创性的工作，PEPperPRINT研究人员获得非常著名的德国科学施蒂夫特奖和德国工业创新大奖等。目前PEPperPRINT公司基于多肽芯片平台已开发出覆盖面非长广的高质量产品，包括微生物相关多肽芯片、肿瘤相关多肽芯片和人源自身多肽芯片等。另外，PEPperPRINT提供多肽芯片定制服务，满足客户在各自领域的研究需求。可在此网址观看多肽芯片的介绍：www.pepperprint.com/downloads/20190327_PepPerPrint_CN_SUBs_v01.mp4
PEPperPRINT的多肽芯片主要用于如下实验：
一、 抗原和表位的发现
PEPperCHIP芯片是最经济的新型抗原和表位一步法研究新方法。PEPperCHIP Discovery Microarrays包含大量不同多肽重叠肽库，允许一次性筛选300个以上的抗原及其表位。PEPperCHIP Custom Microarrays允许客户量身定制标准尺寸的抗原多肽库芯片。
图1，334种目的蛋白制作成为包含一个副本的26,463段不同多肽芯片，这些多肽由具有10aa重叠的15aa多肽组成。实验一用1:1000稀释的对照血清库进行孵育、读数和量化（左上角）。实验二采用病人血清库按照实验一方法进行（右上角），结果显示病人血清库专有地结合一些抗原和表位。出现最大不同染色反应的抗原和表位被挑选出来进行进一步的样本放大实验（右下）。HA（红色）和FLAG（绿色）染色作为抗原和表位发现实验的阳性对照（左下）。
二、 高分辨表位图谱鉴定
PEPperCHIP Peptide Microarrays允许抗体和血清对一种或几种抗原的重叠多肽库进行结合鉴定，从而确定它们的高分辨表位图谱。只需要将抗体或血清与特定的抗原多肽芯片进行孵育，然后后用对应荧光二抗染色便可以获得样本与表位对应的荧光斑点。
由于高密度和多肽容量的灵活性，PEPperCHIP Peptide Microarrays是抗体和血清相关高分辨表位鉴定最理想和最经济的解决方案。高分辨表位图谱鉴定也可以用基于少数抗原的PEPperCHIP Custom Peptide Microarrays或基于多达数百个抗原的PEPperCHIP Discovery Microarrays进行。
图2，PEPperMAP Type 1 Epitope Mapping用于一种单克隆抗体对应抗原表位鉴定，抗原制作成为具有14aa重叠的15aa多肽库。芯片扫描结果（左）和荧光强度图（右）显示特异性结合的相邻几段多肽中的共有基团便为相关抗体的表位。HA（红色）和FLAG（绿色）染色作为抗原制作的多肽芯片的多肽框架对照。
Type 2 Epitope Mapping说明
Type 2 Epitope Mapping是将抗原制备成为三种不同长度的多肽（通常为10，12和15aa）和最大的多肽重叠区域用于高分辨表位图谱鉴定。Type 2 Epitope Mapping允许多克隆样本中重叠表位的详细分析或鉴定不同长度多肽对抗体结合能力的影响。Type 2 Epitope Mapping具有Type 1 Epitope Mapping三倍数量的数据点。
图3，PEPperMAP Type 2 Epitope Mapping用于一种多克隆抗体对应抗原表位鉴定，抗原制作成为10、12和15aa多肽，分别具有9、11和14aa重叠区域的多肽芯片。芯片扫描结果（左）和荧光强度图（右）显示15aa重叠多肽库鉴定的单一抗原表位运用10aa和12aa重叠多肽库可以鉴定出两个相邻的抗原表位。HA（红色）和FLAG（绿色）染色作为抗原制作的多肽芯片的框架对照。
三、 表位决定基替换扫描
表位决定基替代扫描是如下需求的最佳解决方案：
a. 鉴定表位的保守和可变氨基酸位置
b. 鉴定表位的变异型和新的模拟表位
c. 抗体的选择性和交叉反应
d. 多肽疫苗改进
e. 多肽结合物改进
表位决定基替代扫描可以按要求包含特定的非天然氨基酸，比如分子酸和瓜氨酸。
图4，采用表位单一氨基酸替代扫描一个包含12aa的起始多肽。这种芯片扫描（左上）显示一个典型的交换模式，该模式可以转换成一个热图（左下）。氨基酸绘图100%显示野生型表位氨基酸被替代后斑点强度。12个氨基酸中的7个氨基酸是高度保守的，对表位替代容忍度低。HA（红色）和FLAG（绿色）染色作为起始多肽表位单一氨基酸替代扫描的多肽框架对照。
表位双氨基酸替代扫描说明
与表位单一氨基酸替代扫描中逐个替代氨基酸位置相比，表位双氨基酸替代扫描允许更高通量筛选表位变异型和模拟表位，它依靠的是一次替换表位的2个氨基酸位置。表位双氨基酸替代扫描是基于PEPperCHIP Discovery Microarrays构建的。
图5，采用表位双氨基酸替代扫描一个包含11aa的起始多肽。在一个实验中，PEPperCHIP Dciscovery Microarrays覆盖26,400个不同的多肽，可用于多肽变异体的高通量鉴定和优化。HA（红色）和FLAG（绿色）染色作为起始多肽表位双氨基酸替代扫描的多肽框架对照。
四、 免疫监控
免疫监控允许免疫、疫苗或生物给药后抗体反应的指纹分析。与ELISA比较，ELISA仅显示机体是否产生了针对某一抗原的抗体，而PEPperMAP Immune Monitering可将体液免疫反应分解为高和低免疫原性的表位。
一个多肽芯片可以覆盖一个或多个蛋白制作的重叠肽库，该芯片可以用于免疫前样本的结合测试，随后进行免疫后样本的结合测试，这样便可以实现免疫监控，允许非常清晰地对个体抗体反应发展状态进行分析。
另外，来源于不同时间点的血液样品可以对免疫、疫苗或给药后体液免疫反应随时间的发展进行独有的高分辨模式鉴定。
图6，将一个抗原制作为12aa重叠的13aa多肽进行免疫监控。运用免疫前血清（左上）孵育后进行芯片染色后扫描，随后测试两次免疫后血清（中上和右上），结果清晰显示免疫后的体液免疫反应特性，强度图（右下）显示随时间发展抗体亲和增强。免疫后样品产生的信号强度可以提供一个更好的概览。HA（红色）和FLAG（绿色）染色作为抗原来源多肽的对照多肽框架。
五、 抗体交叉反应分析
抗体是治疗、诊断和研究的关键工具。然而，抗体在特异性和交叉反应上往往表征很差[4]。举个例子，来自加拿大多伦多西奈山医院的研究人员在研究一个胰腺癌诊断标志物蛋白CUZD1的过程中，他们买了一个CUZD1检测试剂盒，这个试剂盒包含了一个CUZD1的特异性抗体。他们花了2年时间，花费$500,000和数千病人血清样本后发现这个抗体识别的是另一个肿瘤蛋白CA125，而完全不结合CUZD1。
PEPperCHIP Human Epitome Microarray具有29,128种不同的多肽，包括Immune Epitope Database中人种的全部B细胞线性表位。这个芯片是筛选针对数万种不同抗原多肽的抗体反应的理想工具，这些抗原多肽属于文献报道可与人血浆或血清中抗体反应的序列。三步法包括运用MEME（Multiple Em for Motif Elicitation）进行抗体交叉反应的生物信息学分析，运用FIMO（Find individual Motif Occurrences）中的MEME Suite for motif discovery工具以及热点区域与蛋白数据库中的常见主题的相关性分析。
图7，三步法分析抗体交叉反应
六、 血清生物指标发掘
严重疾病的非侵入性方法早期诊断标志物鉴定非常重要且需求巨大。高通量蛋白芯片是血清中抗体相关生物标志物发掘的有效工具。PEPperCHIP平台的灵活性使得可以逐步从多达35,000段不同多肽中筛选热点区域，并允许对少数多肽进行进一步的鉴定。
七、 激酶底物优化
多肽芯片是激酶底物优化的一个有价值的工具。多肽芯片可以逐步单一氨基酸替代扫描多肽磷酸化作用的位点，运用活化的酪氨酸激酶或丝氨酸／苏氨酸激酶在ATP存在的情况下与单一氨基酸替代扫描芯片共孵育。磷酸化的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸可以用携带荧光的tag进行染色鉴定。相对原型底物，具有更强或更弱磷酸化作用的多肽变体便可以被鉴定出来。
图9，c-Src家族来源两种多肽底物的磷酸化作用，具有最强磷酸化作用的蛋白变体序列列在表格中。根据斑点强度，将多肽底物分为背景（-）、弱（1,000-3,000 FU; +）、中（3,000 – 10,000 FU; ++）、强（10,000 – 20,000 FU; +++）和非常强（> 20,000 FU; ++++）信号，与多肽原型相比替换的氨基酸位置用绿色显示。
八、 多肽结合物优化
多肽芯片可以完美弥补多肽展示筛选库（比如mRNA展示、噬菌体展示或CIS展示）在多肽结合物优化中的应用。多肽展示筛选库具有突出的、多达1013的多肽段数量，可以作为最优的初步筛选工具。初步筛选往往获得数百至数千的多肽位点，这些多肽段需要运用第二轮筛选方法进行第二轮确认。与ELISA法相比，ELISA费时且昂贵，而PEPperCHIP Peptide Microarray只需要一次便可以对数千多肽位点进行二次确认。且结合多肽可以运用单一氨基酸或双氨基酸替代扫描进行亲和力优化。
图10，多达16,000段多肽展示在PEPperCHIP Discovery Microarray上（左上）。该芯片与tag连接的目的蛋白和tag特异性荧光染料共孵育，亲和多肽位点被筛选出来。然后运用单一氨基酸替代扫描（中间）和双氨基酸替代扫描（未显示）进行进一步的亲和优化，结果获得可以与目的蛋白高度亲和的多肽。
参考文献
2. Beyer M, Nesterov A, Block I, König K, Felgenhauer T, Fernandez S, Leibe K, Torralba G, Hausmann M, Trunk U, Lindenstruth V, Bischoff FR, Stadler V, Breitling F. Combinatorial synthesis of peptide arrays onto a microchip. Science. 2007; 318(5858):1888 .
3. Stadler V, Felgenhauer T, Beyer M, Fernandez S, Leibe K, Güttler S, Gröning M, König K, Torralba G, Hausmann M, Lindenstruth V, Nesterov A, Block I, Pipkorn R, Poustka A, Bischoff FR, Breitling F. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47(37):7132-5.
4. Monya Baker. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 2015.
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