尽管染色质免疫沉淀（ChIP）的数据读取技术在不断地发展，但是其DNA富集的方法中存在的缺点却没有很好的改善。CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）作为表观遗传学的研究的一种新型技术方法，对传统的方法进行了重大的修改，以消除ChIP固有的缺点，我们将在下文中详细介绍。

CUT&RUN可用于绘制全基因组转录因子结合位点、染色质相关复合物、组蛋白变体和翻译后修饰的图谱。自该技术面世以来，已有多篇CNS文章利用CUT&RUN技术研究蛋白-DNA的互作。作为ChIP的高效替代方案, CUT&RUN在蛋白质-DNA研究中将会被越来越广泛地使用。

1. 基本原理

CUT&RUN在细胞内利用抗体靶向定位目标蛋白, 再由pA/G-微球菌核酸酶（Micrococcal nucleasel, MNase）对目标蛋白两端的DNA进行切割，从而将目标蛋白质-DNA复合物释放到细胞外。

CUT&RUN原理图

2. 产品优势

四正柏提供的试剂盒对原有的CUT&RUN方法进行改进，适用于1-50万个细胞的研究。

本系列产品有以下优势：

分别对K-562细胞的H3K4me3和H3K27me3所结合的DNA进行测序，用于ChIP的细胞数量为2000万,用于 CUT&RUN的细胞数为50万。对测序结果进行分析，CUT&RUN有着卓越的灵敏度和信噪比，测序深度减少了10倍以上，细胞的需求减少了40倍。

CUT&RUN与Chip-seq对比图

3. 产品信息

常见问题解析

 Q：如何验证一抗在CUT&RUN中起作用？

A：对于CUT＆RUN实验，验证数据可以包括例如 Tapestation或Bionalyzer图显示大小分布，qPCR数据显示靶标富集。由于CUT&RUN的样本量较低，获得的DNA也相对较少，对于低丰度的靶蛋白，浓度通常太低而无法使用荧光测定法或毛细管电泳测量，所以需要选择高灵敏度的Qubit 或 Nanodrop fluorometer以及Tapestation或Bionalyzer。如果获得的DNA＜50bp ，PCR扩增是无法进行的。一旦产生了测序文库并进行了测序图测序，就可以读取并验证读取在已知结合位点的积累。

Q：实验中是否需要使用二抗？

A：二抗的使用取决于抗体和pA/G-MNase融合蛋白的宿主和亚型，对于pA / G-MNase结合，可能是需要的。蛋白A对所有兔IgG抗体具有良好的高亲和力，但对大鼠，山羊和绵羊IgG同种型抗体以及某些小鼠IgG抗体亚类（尤其是IgG1）具有低亲和力。另一方面，蛋白G与小鼠，山羊，绵羊和大多数大鼠IgG的Fc区结合良好。但是，它对兔IgG的亲和力低于蛋白A。当使用我们改进后的CUT＆RUN 方案时通常不需要二抗。原始的方案则需要二抗来确保融合蛋白与抗体的有效结合。

Q：CUN&RUN是否可改造适用于RIP-seq?

A：改善CUT&RUN的操作步骤作用在RNA上，以作为RIP-seq的替代方案是有可能可以实现的。细胞质中的RNA如果缺乏5‘cap和3‘poly-A则易被降解，因此建议选用细胞核作为样本。由于核被膜不含胆固醇，所以不需要使用dignitonin。分离出来的细胞核可通过核被膜上的糖蛋白固定在ConA磁珠上，再加入抗体识别目的蛋白，然后加入pA/G-MNase靶向到抗体上，从而切割RNA。最后将RNA分离出来转录成cDNA并进行测序和定位。

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相关文献

引用产品：CUTANATM pAG-MNase for ChIC/CUT&RUN Assays

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