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流式实验多色方案设计——基础篇

精品资讯 2020-06-22 浏览：1576次

流式细胞仪配置

02
荧光素的亮度与抗原表达量相匹配

1）高水平表达的抗原，如CD3、CD56、CD11c等，搭配低强度的荧光素；

2）实验中表达量变化的抗原，如活化分子、细胞因子等，搭配中强度的荧光素；

3）低水平表达的抗原，或者是我们不太熟悉的抗原，搭配强的荧光素。

03
荧光染料重叠最小化

每种染料有最大的激发光谱和发射光谱，当荧光染料被激光器激发后，会呈现一个右边有拖尾的类似于正态分布的图谱，从光谱上可以看出，不同染料之间有重叠，易发生荧光溢漏。尤其是同一激光的不同通道，更容易发生荧光溢漏。纠正荧光溢漏的过程即称为“荧光补偿”。如果荧光补偿没有调节好，会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图不漂亮，而且会影响到检测结果的真实性。因此，搭配染色方案时，尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC和PE-Cy7；或选择不同激发器激发的荧光素，如FITC和APC，减小相邻通道间的补偿。

04
避免串联染料联合使用带来的假阳性

串联染料是一种通过荧光共振能量转移（FRET）的原理，将小分子染料和荧光蛋白串联在一起组成的染料。常见的如PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等，虽然扩大了发射光谱的范围，但是串联染料不够稳定，对固定和光照敏感，易降解，出现对应两个通道的假阳性。因此在使用串联染料时，务必尽快完成实验。而且Cy5会特异性地结合到Fc受体增加假阳性，因此在检测巨噬细胞、单核细胞、NK细胞等Fc受体高表达的细胞时应尽量减少Cy5的使用。

05
尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本

不同的细胞和组织以及培养基添加物都有不同水平的自发荧光。自发荧光主要的来源包括NADH、核黄素、黄素辅酶分子、固体甲醛中的伯胺分子交联、某种生物结构（如线粒体、溶酶体等）。自发荧光在高波长范围内迅速降低。因此，对自发荧光较强的细胞，如粒细胞，应选择红光如APC，APC-Cy7来激发，可得到较好的S/N比值。

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