7月的盛夏，某医科大学免疫系研一的王同学特烦恼。因为最近他和BV786 anti-mouse CD45R抗体杠上了。
这个简单的鉴定B细胞亚群的抗体，在他自己手里却变得妖妖的，分析数据时发现PE-Texas anti-mouse CD3 和BV786 anti-mouse CD45R两个抗体双染的细胞严重拖尾，如图1所示。
王同学的样本是小鼠脾脏，实验方案是PerCP anti-mouse CD45R/PE-Texas Red anti-mouse CD3/PE-Cy7 anti-mouse CD4/FITC anti-mouse CD8/BV786 anti-mouse CD45R/Zombie NIR Fixable Viability Kit（死活染料）。
由于刚开始做流式实验，不太懂得分析数据，以为是抗体质量问题，所以找我们求助。
拿来王同学的数据，我们进行了分析，如图2所示，和图1对比，发现主要存在以下三个问题：
- 在淋巴细胞设门的时候，把一些碎片和死细胞也圈进去了。对于这种情况，可以先通过死活染料圈出活细胞再圈白细胞或者通过反设门看CD45白细胞来确定淋巴细胞的位置；
- 在分析CD3和CD45R标记物的时候，不清楚双指数和对数坐标的区别，选取了双指数坐标，坐标轴零以下的信号全部显示出来，细胞呈拖尾状。而我们选用对数坐标，只显示坐标轴零以上的数据，流式数据在坐标轴上出现“堆积”的现象，细胞群聚集。坐标轴选取的不同，导致了流式图显示的不同，但是细胞阳性比例差异不大；
- 实验方案里搭配的Zombie 染料使用的是APC-Cy7通道，和BV786荧光素重叠严重，虽然对于结果分析影响不是很大，可是后续在实验方案设计时，荧光通道够用的情况下，尽量避免光谱重叠严重的荧光素一起使用。总体来说，王同学的数据是可用的。
王同学恍然大悟，悻悻地说，我接触流式实验不久，不曾想到做流式实验还有这么多学问。看来还得多多“取经修炼”，这样才能在实验中“斩妖除魔”！
为了让大家更快的成为“得道高僧”，小柏特意准备了珍藏“宝典”供大家学习参考。
在FlowJo软件中可以灵活地调整流式图的坐标轴，包括Linear(线性)，Logarithmic(对数)，Biex(双指数) 三种类型，如下图所示。
其中，线性用于分析散射光参数，如FSC和SSC；Logarithmic和Biex用于分析荧光参数，但对数坐标对于荧光较弱或经过补偿后压轴的数据无法进行显示，流式数据会在坐标轴上出现“堆积”的现象，而双指数可以将流式数据坐标轴零值（压轴）或负值（坐标轴以下的数据）显示出来，而且可以调整Extra Neg. Decades和Width Basis值的大小，在多色流式实验中使用较多。
了解扩展误差（spreading error，SE）
SE是在补偿调节正确的情况下，两个通道之间仍然会出现信号溢漏的情况，在流式图上表现为鱼尾形状。某个通道阳性区域的鱼尾形扩散越大，说明SE越大，对另一个通道的结果分析干扰就越大。
如下图所示，PE-Cy5和APC两个通道光谱重叠严重，即使补偿调节好，仍旧会出现扩展误差。PE-Cy5阳性区域在流式图上呈现鱼尾形，会影响APC阳性信号的圈门。所以，无论从补偿还是扩展误差方面考虑，都最好不要把PE-Cy5和APC搭配在同一个Panel。
SE的产生和补偿无关，跟仪器（激光功率，仪器性能等）和荧光染料有关。因此有必要在设计方案之前，先通过已有的各通道荧光抗体，了解每个通道的SE大小。
检测后的数据在FlowJo分析，在其Compensation Wizard窗口，可计算spillover-spreading matrix (SSM)。这个SSM就基本上可代表SE的大小。
一般SE超过3～4，就提示着对弱表达抗原的分析会存在很大影响。但是目前在多色方案设计中，大家并没有特别关注扩展误差。对于一个好的多色实验方案，存在扩展误差的情况下，只要标记物表达量够高，细胞群阴性和阳性分群明显，也是不影响结果分析的。
荧光信号溢漏在多色流式实验中是影响实验结果的重要因素，三种情况会产生光谱重叠：
1）相邻荧光通道之间产生信号溢漏，如FITC和PE是两个相邻的荧光素，FITC被激发后部分信号溢漏到PE通道，造成PE通道信号的假阳性。
2）串联染料和供体分子之间存在光谱重叠，如PE-Cy7和PE，PE染料是PE-Cy7串联染料的供体，PE-Cy7的发射光谱有两个峰值，次峰和PE通道信号重叠。
3）不同激光激发的、但是发射波长接近的荧光素之间也会发生光谱重叠现象，如BV786和APC-Cy7，它们分别由紫激光和红激光激发，但是用同一个滤光片（780/60）来接收光信号，导致光谱严重重叠。
因此，搭配实验方案时，要考虑这几种情况，尽可能选择窄的发射光谱，使光谱重叠最小化。
对于低表达量的抗原或者是罕见表位的抗原应该搭配中强度荧光素，如PE、APC、BV421等，反之亦然。
实验前要做好抗体滴定，选择具有最小染色背景而不丢失特异性信号的抗体浓度。建议每次实验之前，用染色指数（SI）进行抗体滴定。
如下图所示，用同一个CD3抗体对未固定和固定/破膜细胞进行染色，通过SI确定最佳抗体浓度，可发现Panel B里阴性区域增加的背景信号是由于细胞固定/破膜产生的，胞内染色的最佳SI是表面染色的一半。
死细胞自发荧光很强，容易导致非特异性染色，引起结果不正确，所以排除死细胞很重要。
对于表面染色常用PI、7AAD和DAPI等核酸染料，利用死细胞膜通透性变大，核酸染料可进入细胞内结合DNA的特点来鉴别死细胞和碎片。但是对于胞内的抗原，需要用胺类染料如Zombie来进行死细胞排除。
有此宝典，是不是就可以排忧解难，做出最漂亮的流式结果了？
参考文献：
[1] Richard Nguyen , Stephen Perfetto, etal.Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.Cytometry A. 2013 Mar;83(3):306-15.
[2] Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P.K., & Jain, P. (2017). Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology, 117, 5.4.1–5.4.38.
[3] David Novo,James Wood.Flow cytometry histograms: Transformations, resolution, and display.Cytometry: 73A: 685-692.
有此宝典，是不是就可以排忧解难，做出最漂亮的流式结果了？
客服电话：.png)
.png)
.png)
