自然杀伤细胞（natural killer cells, NK cells）是重要的天然免疫淋巴细胞，在抵御病原体感染、清除肿瘤细胞、调节自身免疫性疾病发展和骨髓、器官移植的免疫排斥等方面发挥了重要的作用。近期研究发现，NK细胞具有免疫记忆功能，并且展现出获得性免疫应答的特征，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。自1975年发现NK细胞以来，人们对NK细胞及NK细胞与其他免疫细胞相互作用的研究逐渐深入。

NK细胞在肿瘤过继性免疫治疗中以其安全性高、毒性反应轻、杀伤作用强等优点显示出了巨大的潜力。在嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞治疗中，CAR-T疗法备受关注，但是同时也存在一些挑战而影响了其广泛的应用。而CAR-NK细胞疗法表现出一定的优势。如从外周血获取的NK细胞无需致敏即可具备杀伤功能，很少发生或几乎不发生GVHD，不会产生大量的炎症因子，具有更广泛的细胞来源，除了从外周血，还可以从脐带血、诱导的多能干细胞（iPSCs）和细胞系如NK-92中获得，可直接冻存备用，方便使用^[1]。有临床数据表明，CAR-NK细胞在CD19+的非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病^[2]和实体瘤如靶向PD-L1的人和小鼠头鳞癌^[3]中显示了极大的安全性和有效性。

在NK细胞的基础研究中，流式细胞技术以其简单方便快速，高通量检测等优点，成为NK细胞研究的有效工具。今天和小柏一起从NK细胞表型和功能方面重新学习一下这个天赋异禀的细胞“杀手”吧。

Part 01

Fc受体封闭

NK细胞、巨噬细胞、B细胞、粒细胞等表达Fc受体，流式实验中，抗体一般带有Fc段，其Fab段跟细胞表面抗原特异性结合，而Fc段会跟细胞表面的Fc受体结合，从而产生非特异性结合，导致高背景染色。因此，在检测NK细胞时，遵循严格的实验条件下，需要进行Fc受体封闭。对于胞内实验，先加死活染料，再进行Fc受体封闭，然后进行抗体染色。目前市面上，针对人和小鼠样本，均有商品化的封闭试剂，而针对大鼠样本的Fc受体封闭，建议选用抗体来源的血清。

Part 02

NK细胞表型鉴定

NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，广泛分布在骨髓、肝脏、淋巴结、脾脏、肺脏和黏膜等器官，不表达特异性抗原识别受体，是不同于T，B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。依照CD56分子的密度不同将人NK细胞分CD56^dim和CD56^bright 两个亚群，人CD56^dim NK细胞亚群占外周血NK细胞的90%，以杀伤功能为主, 产生细胞因子能力较低；而CD56^bright NK细胞亚群具备对细胞因子的增殖应答能力，以分泌细胞因子为主，细胞毒活性较低。

注：NK细胞鉴定要区分小鼠品系，NK1.1比较适合C57BL/6小鼠，但BALB / c、SJL、AKR、CBA/J、C3H和129不表达NK1.1，所以建议用CD49b。

Part 03

NK细胞功能研究

NK细胞能直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞，还能分泌细胞因子实现免疫调节功能，NK细胞通过哪几种方式发挥杀伤作用呢？

包括：

1. NK细胞脱颗粒，释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞；

2. 活化的NK细胞通过释放细胞因子来杀伤靶细胞；

3. 通过细胞死亡受体如Fas/Fasl和TNF-α/TNFR-1途径诱导靶细胞凋亡；

4. 介导ADCC作用杀伤靶细胞。

NK细胞杀伤机制

图片来源 | https://gut.bmj.com/content/60/2/268

以人的PBMCs为例，为您介绍实验方案的搭配。

Part 04

NK细胞活性调节

NK细胞表面表达的受体种类繁多，可分为活化性受体、抑制性受体、黏附分子受体、细胞因子受体和趋化因子受体等，共同决定NK细胞的活化状态。生理情况下，抑制性受体占据主导地位，即抑制性受体识别自身组织细胞表面HLA-Ⅰ类分子，可启动抑制性信号转导，而使活化性受体的功能受到抑制，表现为NK细胞不能杀伤自身正常组织细胞。病理情况下，如某些病毒感染和肿瘤细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达下降或缺失，此时活化性受体即可发挥作用，促使NK细胞杀伤靶细胞。

有文献报道^[4]，在人肾癌组织浸润NK淋巴细胞中，NK细胞比例增加，表达NK细胞的特异性活化受体NKp46，但是活化信号被破坏，NK细胞处于失能状态。同时，发现NK细胞高表达CD94/NKG2A抑制性受体，与肿瘤细胞表面的HLA-E结合，从而抑制NK细胞毒作用。猜想可能是活化信号的缺陷和抑制导致了免疫抑制性肿瘤微环境，为NK细胞的肿瘤免疫治疗提供了思路。

NK细胞自我教育

图片来源 | https://www.cell.com/trends/immunology/fulltext/S1471-4906(11)00098-6?large_figure=true

相信随着科学技术的创新、免疫学的进步、多种学科的交叉以及转化医学的发展，更有NK细胞研究队伍的扩大和科学家们终其一生的坚持和努力，NK细胞的全景图将会完美展现，NK细胞对人类健康的贡献将硕果累累。

参考文献：

[1] Dominique Bollino 1, Tonya J Webb.Chimeric antigen receptor-engineered natural killer and natural killer T cells for cancer immunotherapy.Transl Res.2017 Sep;187:32-43.doi: 10.1016/j.trsl.2017.06.003. Epub 2017 Jun 9.

[2] Enli Liu 1, David Marin 1, Pinaki Banerjee 1, Homer A Macapinlac .Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors.N Engl J Med.2020 Feb 6;382(6):545-553.doi: 10.1056/NEJMoa1910607.

[3] Yvette Robbins 1, Sarah Greene 1, Jay Friedman 1, Paul E Clavijo.Yvette Robbins 1, Sarah Greene 1, Jay Friedman 1, Paul E Clavijo.Elife.2020 Jul 7;9:e54854.doi: 10.7554/eLife.54854.

[4] Julia S Schleypen , Marion Von Geldern, Elisabeth H Weiss,etal.Renal cell carcinoma-infiltrating natural killer cells express differential repertoires of activating and inhibitory receptors and are inhibited by specific HLA class I allotypes.Int J Cancer.2003 Oct 10;106(6):905-12.

[5] Margaret C.Costanzo,Matthew Creegan,Kerri G Lal,etal.OMIP-027：Functional analysis of human natural killer cells.Cytometry A. 2015 Sep;87(9):803-5.doi.10.1002/cyto.a.22719. Epub 2015 Jul 17.

[6] Meichen Ma , Xiaowan Yin , Xue Zhao,etal.CD56 - CD16 + NK cells from HIV-infected individuals negatively regulate IFN-γ production by autologous CD8 + T cells.J Leukoc Biol.2019 Dec;106(6):1313-1323.

[7] Hollie J Pegram 1, Daniel M Andrews, Mark J Smyth,etal.Activating and inhibitory receptors of natural killer cells.Immunol Cell Biol.2011 Feb;89(2):216-24.

全国客服热线：400-7060-959

邮箱：marketing@4abio.com